Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa việt nam

5
Thiết kế các khay trồng lúa có kích thước 15 x 30 x 50cm. Đất không bị nhiễm
mặn được phơi khô, băm nhuyễn vào khay dày khoảng 10cm (tương đương thể tích
khoảng 0,015m
3
/khay). Hạt lúa nảy mầm được gieo thành hàng (10hạt/hàng, 5
hàng/giống) trong khay tưới nước ẩm cho hạt tiếp tục phát triển trong 3 ngày đầu.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với 3 nghiệm thức: 0;
0.3%, 0.6 % muối NaCl (EC= 0; 6; 12dS/m). Đánh giá mức độ chống chịu mặn sau 10
ngày, 16 ngày và 22 ngày sau khi xử lý mặn theo tiêu chuẩn đánh giá SES của IRRI,
1997 (bảng 1)
Bảng 1. Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trưởng và phát triển
Điểm
Quan sát
Mức chống chịu
1
Tăng trưởng bình thường, không có vết cháy lá
Chống chịu tốt
3
Tăng trưởng gần như bình thường, đầu lá hoặc vài lá
có vết trắng, lá hơi cuộn lại
Chống chịu
5
Tăng trưởng chậm lại, hầu hết lá bị cuộn, chỉ có vái
lá còn có thể mọc dài ra,
Chống chịu trung
bình
7
Tăng trưởng bị ngưng hoàn toàn, hầu hết lá bị khô,
một vài chồi bị chết
Nhiễm mặn
9
Tất cả cây bị chết hoặc khô
Rất nhiễm mặn
1.2.3. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa
Tách chiết ADN lúa bằng dung dịch đệm chứa CTAB dựa trên quy trình chuẩn của
Saghai và Maroof (1994)
1.2.3. Nhận dạng di truyền các giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR
40 giống/dòng lúa được nhận dạng di truyền bằng 20 chỉ thị SSR. Phản ứng
PCR được chuẩn bị bao gồm các thành phần: 2µl Buffer 10X; 1,2µl MgCl
2
(25mM);
1µl dNTP(2,5mM); 0,1µl Taq DNA polymerase (5U); 1µl primer forward (20pmol/µl),
1 µl primer reverse (20pmol/µl)), 2µl ADN khuôn (20ng/µl) trong tổng thể tích phản
ứng là 20µl. Chu kỳ nhân gen được thiết kế như sau: 94ºC trong 5 phút; (94ºC trong 1
phút, 56ºC trong 45 giây, 72ºC trong 1 phút) lặp lại 35 lần; 72ºC trong 7 phút; 4ºC
trong 30 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamid 12%, trong môi

6
trường đệm TAE 1X, ở 70V trong 3 giờ 20 phút. Sau khi điện di, bản gel được nhuộm
trong dung dịch Ethidium bromide và soi chụp ảnh bằng máy soi UV Transiluminator.
1.2.4. Phân tích số liệu
Phân tích thống kê một số chỉ tiêu sinh trưởng khi tiến hành đánh giá mặn các
mẫu giống/dòng lúa bằng phần mềm IRRISTAR 5.0
Dữ liệu kiểu gen được xử lý, phân tích bằng phần mềm NTSYS pc 2.11X
(Applied Biosatistics); các chỉ số đánh giá đa dạng di truyền, tần số alen quần thể được
xử lý bằng phần mềm POPGENEv1.32.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

2.1. Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống/dòng lúa
2.1.1. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong
điều kiện phòng thí nghiệm
2.1.1.1. Thời gian sống sót
Kết quả ghi nhận thời gian sống sót của các giống/dòng lúa thanh lọc mặn
trong môi trường EC=16dS/m cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Thời gian
sống sót lâu nhất hơn giống đối chứng Pokkali (21ngày) có 2 giống lúa, đó là Chành
trụi (26 ngày), Nếp cúc (25 ngày). Có 6 giống/dòng có thời gian sống sót tương
đương với Pokkali (20-21 ngày) là Hom râu 1, Bầu Hải Phòng, Cườm dạng 2, Hom
râu 2, CM6, Cườm dạng 1. Có 9 giống có thời gian sống sót gần bằng Pokkali (15-
19ngày) là Ỏn, Nước mặn, Quảng trắng, Lúa ngoi, Mành gié, Lúa su dạng 1. Lúa
chăm biển, Ngoi tía, Chiêm cũ. Các giống còn lại có thời gian sống sót thấp, gồm
22 giống chiếm 55%. Giống chuẩn nhiễm IR28 sống sót được 8 ngày trong môi
trường muối 16dS/m. Ghi nhận từ kết quả thực nghiệm chúng tôi thấy nồng độ muối
càng cao thì thời gian sống sót của các giống/dòng lúa càng thấp và ngược lại. Ở
môi trường EC= 0dS/m, 100% các giống/dòng lúa đều sống sót sau 35 ngày, nhưng
trong môi trường dinh dưỡng có NaCl với EC=6dS/m, thời gian sống sót trung bình
của các giống/dòng lúa là 29.6 ngày và ở môi trường dinh dưỡng có NaCl với
EC=16dS/m, thời gian sống sót trung bình của các giống/dòng là 14.5 ngày.
2.1.1.2. Chiều cao thân

7
Kết quả phân tích phương sai cho thấy ở nồng độ muối khác nhau đều dẫn
đến chiều cao thân khác nhau có ý nghĩa thống kê. Ở trong môi trường dinh dưỡng
Yoshida có muối với nồng độ 0.3% (EC=6dS/m), kết quả ghi nhận cho thấy đa số
các giống có chiều cao trong khoảng 22- 26cm. Chiều cao trung bình của các
giống/dòng lúa là 24.41cm. Giống Cườm dạng 1 có chiều cao thân cao nhất
(28.23cm) và giống có chiều cao thân thấp nhất là IR28 (19.40cm). Ở trong môi
trường dinh dưỡng có muối với nồng độ 0.8% (EC= 16dS/m), đa số các
giống/dòng lúa thí nghiệm có chiều cao trong khoảng 17-21cm. Chiều cao trung
bình là 19.64cm. Các giống có chiều cao vượt trội, cao hơn hẳn giống đối chứng
Pokkali (21.67cm) và có ý nghĩa khác biệt khi phân tích thống kê là Tẻ chăm,
Chành trụi, Cườm dạng 2, Lúa ngoi, Hom râu 2, Cườm dạng 1, Lúa chăm biển, Ré
trắng. Các dòng có chiều cao tương đương giống đối chứng Pokkali (không khác
nhau về mặt thống kê) là Quảng trắng, Lúa đỏ, Nghi hương, Chiêm cũ. Có 4
giống/dòng (Lúa ven dạng 1, Nước mặn dạng 1, Ngoi tía, IR352) có chiều cao thân
khá, cao hơn chiều cao thân trung bình. Như vậy, chiều cao cây và khả năng chịu
mặn tỷ lệ nghịch với nhau. Nồng độ muối càng cao thì chiều cao cây càng giảm.
2.1.1.3. Chiều dài rễ
Chiều dài rễ trung bình của 40 giống/dòng lúa trong môi trường dinh dưỡng
có muối với nồng độ 0.8% (EC=16dS/m) là 8.37cm. Giống đối chứng Pokkali có
chiều dài rễ là 9.77cm, có 6 giống/dòng có chiều dài tương đương với giống đối
chứng (khác biệt không có ý nghĩa thống kê) là Nếp cúc, Nước mặn dạng 1, CM6,
Q5, Cườm dạng 1, Ngoi tía, ngoài ra các giống Ỏn, Bầu Hải Phòng, Nước mặn,
Lúa chăm biển, Hom râu 2, Tám dự, Lúa chăm biển, Ré trắng, Tẻ tép, Nếp chẩn có
chiều dài rễ khá. Tuy nhiên, trong dung dịch Yoshida có muối với nồng độ thấp hơn
(EC=6dS/m), các giống/dòng lúa có chiều dài rễ trung bình là 11.76cm. Trong đó,
Hom râu 2 có chiều dài rễ dài nhất là 14.49cm và giống có chiều dài rễ thấp nhất là
Quảng trắng (9.76cm), giống Pokkali có chiều dài rễ tương đối cao là 13.13cm.
2.1.1.4. Trọng lượng khô thân
Khi phân tích phương sai kết quả ghi nhận trọng lượng khô thân của bộ giống
nghiên cứu trong hai môi trường muối khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống

8
kê. Trọng lượng khô thân trung bình của các giống/ dòng lúa đạt 116.22mg trong môi
trường dinh dưỡng có muối với độ dẫn điện EC=6dS/m. Ghi nhận kết quả trọng lượng
khô thân của 40 giống/dòng lúa thí nghiệm trong môi trường có độ dẫn điện EC=16dS/m
cho thấy, trọng lượng trung bình chỉ đạt 93.63 mg. Giống chuẩn kháng Pokkali là giống
có trọng lượng thân cao nhất (131.45mg), khác biệt rất có ý nghĩa với giống chuẩn
nhiễm IR28 có trọng lượng khô thân là 59.34mg. Một số giống có trọng lượng khô thân
tương đối cao, gần băng Pokkali là Chiêm rong, Chành trụi, Ven đỏ, Nếp cúc.
2.1.1.5. Trọng lượng khô rễ
Kết quả ghi nhận trọng lượng khô rễ của các giống/dòng lúa thí nghiệm cho thấy
sự khác biệt khi phân tích thống kê. Ở trong môi trường dinh dưỡng có muối với
EC=16dS/m, các giống có trọng lượng khô rễ trung bình là 27.03 mg. Giống Pokkali
(chuẩn kháng) có trọng lượng khô rễ cao (39.14mg), khác biệt rất có ý nghĩa với các
giống/dòng lúa còn lại trong thí nghiệm, duy chỉ có giống Chành trụi có trọng lượng khô
rễ cao hơn giống đối chứng là 40.33mg. Có 3 giống là Lúa su dạng 1, CM6, Lúa ven
dạng 1 có trọng lượng khô rễ tương đối cao, gần bằng giống Pokkali. Giống chuẩn
nhiễm IR28 có trọng lượng khô rễ là 25.75mg và là giống có trọng lượng khô rễ trung
bình. Hai giống Nếp quấn, Ven đỏ có trọng lượng khô rễ thấp nhất là 20,06mg.
Ghi nhận kết quả ở môi trường dinh dưỡng có NaCl 0.3 đa số các giống/dòng lúa
có trọng lượng khô rễ từ 26-31mg và có trọng lượng khô rễ trung bình đạt 29.56 mg.
2.1.2.6. Đánh giá mức độ chống chịu mặn
Kết quả ban đầu cho thấy, cây mạ trong môi trường dinh dưỡng có muối NaCl
với nồng độ 6dS/m, sau 7 ngày xử lý mặn chỉ có 2 giống Khang dân và AC5 ảnh
hưởng cấp độ 3, đến 14 ngày sau khi xử lý mặn cây mạ bị ảnh hưởng chủ yếu ở cấp
3-5; sau 21 ngày đa số các giống/dòng lúa bị ảnh hưởng chủ yếu ở cấp 5-7, 4
giống/dòng lúa bị chết (cấp 9) chiếm 10% là Khang dân, AC5, Q5, Ven đỏ.
Ở trong môi trường trường dinh dưỡng có muối NaCl với độ dẫn điện
EC=16dS/m, sau 7 ngày xử lý mặn giống chuẩn nhiễm IR28 có biểu hiện ở cấp 7,
giống Pokkali có biểu hiện ở cấp 3, đa số các giống/dòng lúa khác bị nhiễm cấp 5-7.
Vào 14 ngày sau xử lý mặn thì giống IR28 bị nhiễm cấp 9 (chết), giống Pokkali biểu
hiện ở cấp 5 cùng với 13 giống/dòng lúa có biểu hiện tương đương Nước mặn, Lúa su

9
dạng 1, Lúa ven, Quảng trắng, Hom râu 1, Hom râu 2, Cườm dạng 1, Chiêm rong,
Lúa chăm biển, Mành ré, Chiêm cũ, Bầu Hải Phòng, Ỏn. 9 giống/dòng lúa còn sống
sau 21 ngày xử lý mặn là Ỏn, Bầu Hải Phòng, Lúa ven dạng 1, Pokkali, Mành gié,
Hom râu 2, Lúa su dạng 1, Cườm dạng 1, Chiêm cũ nhưng ở mỗi giống chỉ còn lại
vài cây bị nhiễm ở cấp 7(chiếm 22.5%), chỉ có Chành trụi, Cườm dạng 2, Nếp cúc là
nhẹ hơn, cấp 5 (chiếm 7.5%).

Hình 1: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % mức chống chịu mặn của 40 giống/dòng lúa nghiên
cứu trong dung dịch Yoshida có NaCl với EC=6dS/m và EC=16dS/m





Mạ sau 21 ngày xử lý mặn (EC=6dS/m) Mạ sau 21 ngày xử lý mặn (EC=6dS/m)





Mạ sau 17 ngày xử lý mặn (EC=0dS/m) Mạ sau 17 ngày xử lý mặn (EC=16dS/m)
Hình 2: Thí nghiệm thanh lọc mặn các giống/dòng lúa nghiên cứu trong điều kiện
phòng thí nghiệm


10
2.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong
điều kiện nhà lƣới
2.1.2.1. Tỷ lệ sống sót
Ở điều kiện nhiễm mặn với nồng độ 0.3% (EC=6dS/m), giống IR28 chết vào
thời điểm 21 ngày sau khi xử lý mặn. Đa phần các giống/dòng lúa có tỷ lệ sống sót trên
50%, trong đó có 6 giống có tỷ lệ sống sót > 70%, 25 giống có tỷ lệ sống sót từ 51-
70%, 5 giống có tỷ lệ sống sót nằm trong khoảng 31-50%, 4 giống/dòng lúa có tỷ lệ
sống sót <30% Ở điều kiện nhiễm mặn nồng độ 0.6% (EC=12dS/m), giống IR 28 chết
vào thời điểm 15 ngày sau khi xử lý mặn. Trong đó, 9 giống/dòng lúa có tỷ lệ sống sót
<30%, 12 giống/dòng lúa có tỷ lệ sống sót từ 31-50%, 15 giống/dòng lúa có tỷ lệ sống
sót từ 51-70%, 4 giống/dòng lúa có tỷ lệ sống sót >70% là Chành trụi, Nếp cúc,
Pokkali, Cườm dạng 2.

Hình 3: Biểu đồ biểu diễn % tỷ lệ sống sót của các giống/dòng lúa nghiên cứu trồng
trong đất có NaCl với EC=6dS/m, EC=12dS/m
2.1.2.2. Mức độ chống chịu mặn
Kết quả đánh giá khả năng kháng mặn của bộ giống lúa nghiên cứu được thể
hiện ở hình 4 cho thấy trong điều kiện 0dS/m, cây mạ tăng trưởng bình thường không
có triệu chứng bị nhiễm mặn. Trong môi trường có bổ sung thêm nước muối với 0.3%
NaCl (độ dẫn điện EC=6dS/m), cây mạ bắt đầu bị ảnh hưởng do mặn và mức độ bị ảnh
hưởng tăng dần theo thời gian. Sau 10 ngày xử lý mặn ngoài tự nhiên, hầu hết các
giống/dòng chưa bị ảnh hưởng nhiều, chỉ có 6 giống/dòng lúa là Tám thơm, IR28, Q5,
Khang dân 18, AC5, P6 ảnh hưởng đến cấp 3 (chiếm 15%), đến 16 ngày cây mạ bị ảnh
hưởng chủ yếu ở cấp 3-5. Sau 22 ngày đa số các giống/dòng vẫn sống, trong đó 14

11
giống/dòng bị ảnh hưởng ở cấp3, 11 giống/dòng lúa bị ảnh hưởng ở cấp 5, 11
giống/dòng lúa ở cấp 7 và 4 giống/dòng lúa ( IR28, P6, AC5, Khang dân 18) bị ảnh
hưởng nặng nhất ở cấp 9.
Khi xử lý mặn các giống/dòng lúa nghiên cứu ở nồng độ 0,6% (EC=12dS/m)
thì sau 10 ngày ảnh hưởng mặn tới một số giống/dòng lúa, IR28 biểu hiện ở cấp 5,
giống chuẩn kháng Pokkali biểu hiện ở cấp 3, đa số các giống/dòng lúa khác bị nhiễm
cấp 5-7. Sau 16 ngày xử lý mặn giống IR28 bị chết, giống Pokkali biểu hiện ở cấp 3
(kháng mặn tốt) cùng với 3 giống có biểu hiện tương đương là Chành trụi, Cườm dạng
2, Nếp cúc. 23 giống/dòng lúa có biểu hiện cấp 5 là Ỏn, Hom râu1, Bầu Hải Phòng,
Nước mặn, Háu trắng, Lúa ven dạng 1, Tẻ chăm, Quảng trắng, Nước mặn dạng1,
Chiêm rong, Mành gié, Hom râu 2, CM6, P6, Nghi hương, Tám dự, Lúa su dạng 1,
Cườm dạng 1, Lúa Chăm biển, Ngoi tía, Ré trắng, Chiêm cũ, Tẻ tép chiếm tỷ lệ 57.5%.
Số giống/dòng lúa sống sau 22 ngày sau khi xử lý mặn là 38 giống/dòng lúa nhưng khả
năng sinh trưởng đã bị giảm, ở mỗi giống/dòng chỉ còn vài cây bị nhiễm ở cấp 7.
Giống Pokkali, Chành trụi, Cườm dạng 2, Nếp cúc vẫn ở mức kháng mặn trung bình
(cấp5). Như vậy, sau khi giống chuẩn nhiễm IR28 bị chết, có 4 giống (chiếm 10%) có
biểu hiện mức kháng mặn cao, 23 giống/dòng lúa (chiếm 57.5%) biểu hiện khả năng
kháng mặn ở mức trung bình cấp 5, 11 giống/dòng lúa (chiếm 27.5%) tăng trưởng bị
ngưng hoàn toàn, hầu hết lá bị khô, một vài chồi bị chết (cấp7).

Hình 4: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % mức chống chịu mặn của 40 giống/dòng lúa nghiên
cứu trồng trong đất có NaCl với EC=6dS/m và EC=12dS/m

12
2.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số
Kết quả tách chiết ADN bằng phương pháp CTAB cải tiến thu được ADN
nguyên vẹn, độ tinh sạch cao và có nồng độ khá lớn, từ 150- 300ng/µl, đảm bảo đủ
điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (Hình 5)




Hình 5: Kết quả tách chiết ADN tổng số lúa
Số TT: 1đến 40: các giống/dòng lúa theo danh sách mẫu (phụ lục 1)
2.3. Kết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide
Sản phẩm PCR-SSR được điện di trên gel polyacrylamide 8% để phân tích mối
tương quan di truyền liên quan đến tính chịu mặn của bộ giống/dòng lúa nghiên cứu
Tổng số thu được 800 mẫu phản ứng PCR (tổ hợp PCR).





Hình 6: Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM339
M: ADN 50bp ladder Số 1-40: thứ tự các mẫu giống/dòng lúa (phụ lục 1)





Hình 7: Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR- RM261
M: ADN 50bp ladder Số 1-40: thứ tự các mẫu giống/dòng lúa (phụ lục 1)

13
Thống kê trên 20 locut SSR, sản phẩm PCR là các băng có kích thước nằm
trong khoảng từ 110-300bp, kích thước phổ biến của các alen thu được trong bộ
giống lúa nghiên cứu biến thiên trong khoảng 120- 250bp.

Hình 8: Biến động kích thước của các alen tại locut SSR khảo sát.
Thống kê kết quả nhân gen 40 giống/dòng lúa bằng 20 chỉ thị SSR được thể
hiện ở hình 9. Tổng số alen được phát hiện tại 20 locut là 144. Số alen đa hình tại mỗi
locut biến động từ 3 đến 11, đạt trung bình là 7,2 alen/locut. Số lượng alen nhiều nhất
là 11 (RM235), đạt 10 alen (RM140, RM201, RM493, RM1233) và 9 alen 9(RM202).
Locut cho ít đa hình nhất (3alen) tại RM5963.
Bằng phần mềm POPGENE 3.1, tần số alen của mỗi locut được tính toán dựa
trên số liệu nhận dạng di truyền của 40 giống/dòng lúa và là cơ sở để xác định các chỉ
số đa dạng di truyền. Trong số 20 chỉ thị SSR, có 12 chỉ thị cho nhận dạng đặc biệt
(unique allele). Các băng kích thước nằm trong khoảng 100-250bp. Tần số allen phổ
biến nhất dao động từ 15.79 % đến 85%, trung bình là 40.07% (bảng 2). Hệ số đa dạng
di truyền PIC (Polymorphism Information Content) được coi là thước đo tính đa hình
của các alen trong từng locut SSR. Số liệu ở bảng 2 cho thấy các giống/dòng lúa
nghiên cứu rất đa dạng về thành phần các alen ở các locut được nghiên cứu. Hệ số PIC
thu được tại các locut SSR biến động từ 0,265 (locut RM5926) đến 0.889 (locut
RM235) với giá trị trung bình là 0.713, cho thấy mức độ đa dạng gen tồn tại trong 40
mẫu lúa nghiên cứu ở mức khá cao.

14


Hình 9: Kết quả phản ứng PCR của 40 giống/dòng lúa với 20 cặp mồi SSR
(ô đen- có alen được ghi nhận; ô trắng – không có alen được ghi nhận)

Xem chi tiết: Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa việt nam